北京市肺炭疽實驗室檢測技術(shù)方案（試行）

一、樣本前處理

（一）對于放在密封塑料管中的拭子樣本，加入1mL無菌生理鹽水，充分振蕩，放置5-10分鐘，取浸出液進行檢測；

（二）對于痰液，加入等體積痰消化液，混勻后放置5-10分鐘，取上清液進行檢測；

（三）對于糞便和嘔吐物，加入等體積無菌生理鹽水，混勻后取上清進行檢測；

（四）對于土壤、草料、皮毛等外環(huán)境樣本，加入適量無菌生理鹽水漂洗，取上清液進行檢測；培養(yǎng)前在65℃加熱25-30分鐘殺死雜菌；

二、樣本檢測方法

（一）直接鏡檢

取經(jīng)過預(yù)處理的樣本、液體樣本（如腦脊液、血液）少量，直接涂片，革蘭氏染色后在100倍油鏡下觀察。發(fā)現(xiàn)鏈狀排列的革蘭氏染色陽性大桿菌、兩端平齊、芽胞位于細胞中間位置時，判斷為炭疽芽胞桿菌直接鏡檢陽性。

（二）抗原膠體金快速檢測

取炭疽芽胞桿菌抗原膠體金檢測試劑條，在樣本孔中加入經(jīng)過預(yù)處理的樣本、液體樣本（如腦脊液、全血）50 μＬ，質(zhì)控帶顯色后1分鐘內(nèi)觀察。質(zhì)控帶和樣本帶同時顯色判斷為陽性，單一質(zhì)控帶顯色為陰性，質(zhì)控帶未顯色試驗失敗，需重復(fù)檢測。

（三）炭疽芽胞桿菌抗體膠體金快速檢測

取炭疽芽胞桿菌抗體膠體金檢測試劑條，在樣本孔中加入血清樣本50 uL，質(zhì)控帶顯色后1分鐘內(nèi)觀察。質(zhì)控帶和樣本帶同時顯色判斷為陽性，單一質(zhì)控帶顯色為陰性，質(zhì)控帶未顯色試驗失敗，需重復(fù)檢測。

（四）PCR檢測

1、模板的制備

經(jīng)過處理的樣本、液體樣本、培養(yǎng)后的菌落采用商品化試劑盒提取核酸，按照試劑盒說明書進行操作。提取的核酸溶解在TE溶液中。對培養(yǎng)后菌落可用加熱法快速提取核酸：挑取1-2個菌落加入EP管中，加入150 μＬ去離子水并混均后100℃處理10 min，12000 rpm離心5分鐘，取上清液作為模板。

2、引物、探針序列如下表所示。

3、PCR 反應(yīng)體系(25μL/份)

4、結(jié)果判斷：

Ct值在15-40之間且陰性對照成立，判斷為PCR反應(yīng)陽性。pagA基因和cap基因陽性同時可判斷為樣本中炭疽芽胞桿菌核酸陽性。

（五）分離培養(yǎng)和鑒定

1、樣本接種培養(yǎng)

取經(jīng)過預(yù)處理的樣本、液體樣本少量，在營養(yǎng)瓊脂平板和血瓊脂平板上劃線接種，37℃培養(yǎng)24-48 h?？梢删湫螒B(tài)為扁平粗糙，灰白色，干燥，邊緣不整齊；培養(yǎng)20 h以內(nèi)的菌落在低倍鏡下呈卷發(fā)狀；血平板上菌落周圍不產(chǎn)生溶血環(huán)。

2、染色鑒定

取部分可疑菌落涂片，經(jīng)革蘭氏染色，在100倍油鏡下發(fā)現(xiàn)革蘭氏染色陽性大桿菌，兩端平齊，長鏈狀排列，原生質(zhì)相連呈竹節(jié)狀，具有典型卵圓形芽胞，靠近細胞中央或靠近邊緣，細胞不膨脹，判斷為炭疽芽胞桿菌。

3、青霉素敏感試驗和噬菌體敏感試驗

可疑菌落經(jīng)分離純化培養(yǎng)（37℃，24h）后，取純菌均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，平板一側(cè)中央無菌操作放一片青霉素藥敏紙片（10 U/mL）;另一側(cè)滴加一滴炭疽噬菌體，略傾斜平板使噬菌體流下一段距離。

在37℃下培養(yǎng)24h。觀察藥敏紙片周圍細菌生長情況和噬菌斑形成情況。青霉素藥敏紙片周圍無生長且形成長淚滴狀噬菌斑可判斷為炭疽芽胞桿菌陽性。

三、生物安全要求

從事樣本檢測的技術(shù)人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)和具備相應(yīng)的實驗技能，在檢測的過程中樣本檢測人員必需采取傳染病二級防護措施，即佩戴N95醫(yī)用防護口罩、工作帽、護目鏡或面屏、雙層醫(yī)用乳膠手套、醫(yī)用連體防護服、工作鞋和鞋套。

樣本檢測應(yīng)生物安全二級（BSL-2）及以上實驗室內(nèi)進行。樣本檢測，包括打開樣本管及檢測操作等須在二級及以上生物安全柜內(nèi)進行。提取的核酸樣本可在生物安全一級（BSL-1）實驗室進行擴增檢測。大量活菌操作須在生物安全三級（BSL-3）實驗室內(nèi)進行。樣本采集過程產(chǎn)生的廢棄物須在現(xiàn)場放入黃色垃圾袋中并密封，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌處理30 min后方可廢棄。檢測過程產(chǎn)生的廢棄物，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌處理30min方可廢棄。

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來源：北京疾控